研究首次获得基因敲入的食蟹猴

由于基因修饰猴模型可用于模拟人类疾病症状，因此它可作为研究人类疾病机制和推进临床治疗的工具。然而，普通猴具有繁殖周期长(5-6年一代)，幼仔数量少（每胎一只）以及基因编辑效率低等特点，导致构建靶向基因编辑猴具有很大困难和挑战性。一些研究表明，CRISPR/Cas9系统可以用于构建基因敲除猴。与基因敲除相反，由于种种原因例如效率低，到目前为止仍未有基因成功敲入猴的报道。

基于实验室以往研究，同源臂介导的末端接合（HMEJ）的方法可以有效地在猕猴胚胎上实现高效的靶向基因整合。研究人员进一步优化受精卵注入条件，包括供体质粒浓度以及注射剂量，期望在提高敲入效率的同时保持正常的胚胎发育，进而获得基因敲入的猴子。

研究人员在Actb(β-actin)位点插入p2A-mCherry以实现mCherry在Actb启动子的控制下表达。在经历完整的怀孕周期后，获得一对双胞胎猴（#1，雄；#2，雌）和三只单胎的雌性猴 (#3、#4和#5)。通过直接表皮荧光观察两只新生猴(#1,#5)的脚趾发现，与野生型相比，#1和#5展现出mCherry荧光(图A)。对两只死亡雌猴子(#2，#3)的各个组织进行切片观察，发现尾巴、脚趾、心脏、肌肉、心脏、肾、大脑和卵巢均显示出不同嵌合程度的mCherry表达。研究人员在卵巢的大部分区域都检测到mCherry的表达，说明基因敲入猴子具有生殖系传递的可能性(图B)。所有组织的PCR鉴定测序结果都表明，在5’和3’连接处的整合是正确的。此外，Southern印迹分析进一步证实#2和#3猴的基因整合是正确且没有额外的基因随机整合(图C)。

研究人员利用CRISPR/Cas9介导的HMEJ策略，通过一细胞胚胎注射首次获得基因靶向整合的食蟹猴。基于其强大的DNA敲入效率和高保真性，HMEJ介导的敲入策略为构建靶向基因修饰的猴模型提供了可能性。

研究工作得到了国家科技重大专项、中科院战略性先导科技专项、国家高科技研发项目国家自然科学基金会、中国青年千人计划、中科院重大突破项目、国家关键技术研发项目、上海市科学技术委员会项目、中科院百人计划等的资助。

用HMEJ策略获得Actb位点p2A-mCherry基因敲入猴。

（A）基因敲入食蟹猴幼仔。上部分，两只（1#和5#）存活幼仔的照片；下部分，两只（1#和5#）存活幼仔脚趾的荧光照片。红色箭头指示基因敲入猴的脚趾，黑色箭头指示野生型猴的脚趾。图片是从年龄相似的猴采集的：1#，5#和WT-1年龄都是大约1个月。

（B）两只死亡猴卵巢组织切片的mCherry和MVH的代表性荧光图片。MVH，原始精细胞的标记分子。插入图，高放大倍数图。蓝色，DAPI；绿色，MVH；红色，mCherry。标尺，100μm。（C）Southern Blot印迹杂交分析。NdeI酶消化和BglII酶消化的2#和3#猴子的基因组DNA分别用内部mCherry探针和3’外部探针进行杂交。内部mCherry探针期望的片段大小：野生型=无条带，基因整合=3.5Kb。3’外部探针期望的片段大小：野生型=4.4Kb，基因整合=5.4Kb。