科学家完成CRISPR-Cas13a介导的精确定点RNA编辑的人工机器

近日，国际学术期刊Nucleic Acids Research 在线发表了中国科学院分子植物科学卓越创新中心/植物生理生态研究所李轩研究组合作完成的题为Implementation of the CRISPR-Cas13a system in fission yeast and its repurposing for precise RNA editing 的研究论文。该工作报道了一个利用新发现CRISPR家族中的Cas13蛋白（VI 型）及其指导RNA(guide RNA)靶向结合特异序列单链RNA的能力，通过设计改造并与人源的RNA脱氨酶催化结构域（hADAR2d）结合，实现了精确定点RNA（A→I）编辑的人工机器。与近年来利用CRISPR家族蛋白（例如Cas9）对DNA编辑来修改基因/调控基因表达不同，Cas13体系不涉及编码基因DNA的改变，而是通过对基因转录产物（mRNA）进行编辑，为改变基因功能和调控表达提供了新的方法和思路。

近年来利用CRISPR技术对生物物种基因DNA的编辑（包括切割和碱基替换），获得了巨大的成功，同时也面临技术上的限制。与DNA编辑技术互补，一个针对RNA的精确定点编辑技术，有独特的技术优势和应用。与DNA编辑技术相比，RNA的定点编辑不改变编码基因本身（DNA碱基改变后不能逆转），在时间上、空间上和效率上更加可控。同时，RNA编辑可以同时修改多个基因、同时靶向多拷贝基因的所有转录产物（尤其是对多倍体的物种），所以更加高效。在对疾病的基因治疗领域，利用RNA定点编辑修复疾病组织的突变基因，有着重要的应用价值。

为了实现精确定点RNA编辑的人工机器，李轩研究组与研究员杨晟、中科院上海巴斯德研究所研究员郝沛及美国密歇根大学教授王红兵合作，对新发现CRISPR家族中具有结合特异序列单链RNA能力的Cas13a，首先在模式生物裂殖酵母（S pombe）中实现了其靶向内源RNA和降解靶标RNA的功能。进一步，设计利用Cas13a的改造产物dCas13a（丧失RNA切割活性的突变），将dCas13a与人源的RNA腺嘌呤脱氨酶催化结构域（hADAR2d）融合，引入到裂殖酵母中；再通过设计RNA编辑机器的靶向“零件”指导RNA，实现了对内源RNA的精确定点编辑。为了对RNA定点编辑机器的设计和参数（编辑碱基位置、距离、指导RNA结构和长度等）进行优化，研究人员构建了一系列不同的设计，并利用一个双荧光报告（reporter）系统来测试不同设置的编辑效率，从而获得了精准RNA编辑机器的最优参数。优化后的编辑机器对内源靶标RNA的编辑效率达到了59%。最后，该研究实现的精准RNA编辑机器的功能，进一步体现在对裂殖酵母反转录转座子Tf1突变株的修复和操作的实验中。Tf1与动物细胞的逆转录病毒类似，其跳跃和扩增需要经过中间体RNA的逆转录步骤。研究人员利用精准RNA